常见问题

我们获得带有外源基因的重组病毒的程序如下图所示：

首先，我们的qBac-IIIG是目前产量最高的商业化表达载体；其次，我们具有明显的价格优势；再次，我们是国内现货供货，付款后48小时之内通过顺丰快递发货；最重要的，我们的产品具有完全的知识产权。

其他公司产品的价格可以参考他们的官网或代理：

FlashBac:https://oetltd.com/product-category/baculovirus-products/baculovirus-kits/

Bac-to-Bac:https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10359016

BaculoDirect:https://www.thermofisher.com/cn/zh/home/life-science/protein-biology/protein-expression/insect-protein-expression/baculodirect-baculovirus-expression-system.html

BacPAK:http://www.takarabiomed.com.cn/ProductShow.aspx?m=20141220170055623138&productID=20141226105417080421

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您可以通过E-mail (info@bacmid.com)或电话（17629299201）联系我们获得技术支持。

Shaanxi Bacmid Biotechnology Co., Ltd

很简单。

只要把基因克隆到转移质粒上（我们提供的pQB系列转移载体质粒或pIEx/BAC、pBAC、pTriEx、pOET、pBacPAK等兼容质粒），然后再与qBac Bacmid共转染细胞即可获得重组病毒。其实您在用Bac-to-Bac系统时也需要做一次克隆，即把基因克隆到供体质粒上，也需要做一次转染。我们省略了把质粒转化到DH10Bac™ E. coli中转座和蓝白斑筛选等步骤。

了解更多，请点击此链接。

请进入我们的下载页面 资源与下载 找找，如果没有您想要的资料，请联系我们。

真核生物表达蛋白，均需要考虑Kozak序列。一般说来，转移载体质粒上都预先设置了Kozak序列。

为了确保重组蛋白的正确表达，载体构建中应避免移码突变，移码突变会导致表达失败。我们的载体质粒已经过优化以避免移码突变，所以客户只需选取限制性酶切位点即可，无需过分担忧移码突变风险。

在重组蛋白表达中，通常需要根据物种的密码子偏好性进行序列优化，密码子优化通常被用来提高蛋白的表达水平。密码子优化能够赋予重组蛋白更高的表达量，但不能明显促进重组蛋白的可溶性。大部分时候，密码子优化能够显著提升重组蛋白的表达量，但也有密码子优化导致重组蛋白表达量降低（甚至不表达）的案例。我们建议，审慎地进行密码子优化，在尽量维持重组蛋白活性的前提下，通过密码子优化来获得更高产量的重组蛋白。

可以通过无缝克隆的方式，也可以通过传统的酶切连接。

根据不同需要，蛋白表达可以有三种策略，分别适用于重组蛋白的胞内表达、分泌表达和表面展示。

蛋白的分泌有特定的途径和过程，在特定的蛋白收取时机下，可能还有大量的蛋白由于未完成分泌过程而滞留于细胞内，这种情况下收取细胞内的蛋白可以获得更高的蛋白得率。另外，有些蛋白一旦分泌到培养基中，可能不利于其自身活性的维持和自组装活性的表现，这类蛋白也建议采用胞内表达的策略。

通常情况下，昆虫细胞杆状病毒表达系统中采用gp64/gp67的信号肽来实现重组蛋白的分泌，另外，蜂毒蛋白和蚕丝蛋白的信号肽也具有类似用途。信号肽不仅可以促进蛋白的分泌，也有利于蛋白的折叠，有些时候蛋白自身的信号肽也可以应用于昆虫细胞杆状病毒表达系统，即使蛋白来源于人或其他哺乳动物。

我们录制了相关的视频，观看请点击这里。

我们尝试了多款性能优越的转染试剂，因昆虫细胞具有其特殊之处，目前我们采用FuGENE^® HD 转染试剂（Catalog number: E2311），来实现标准化的高效率转染。

因为Bacmid制备过程无法保证完全无菌，所以我们建议培养基中一定要添加抗生素（100UI/ml氨苄青霉素和100UI/ml链霉素）。

转染是为了将带有目的基因的重组载体质粒和bacmid共转染入昆虫细胞，利用昆虫细胞自身的重组系统来包装出具有感染性的杆状病毒。随着杆状病毒的复制，我们会收获P0代杆状病毒。然而因目的基因差异和细胞状态差异等因素，这个步骤很难达到100%的转染效率，收获的杆状病毒滴度往往不能达到最佳水平。通过随后进行的感染实验大量繁殖杆状病毒，使其达到足够高的滴度和足够大的体积，保证后续实验的顺利开展。

感染复数（multiplicity of infection， MOI）=病毒数量/细胞数量。通常采用MOI=0.05-0.1来进行杆状病毒的增殖，采用MOI=3-5来进行重组蛋白的表达。杆状病毒增殖过程中采用低MOI，从而避免大量病毒基因组之间发生同源重组导致缺陷型病毒的产生；重组蛋白表达过程中采用高MOI，从而实现重组蛋白的大量表达。

A: 病毒滴度一般分为物理滴度和感染滴度（生物滴度）。物理滴度是指包含病毒基因组的病毒颗粒浓度，通常利用实时定量PCR来测定；感染滴度是指具有感染性的病毒粒子浓度，通常用TCID50法来测定。物理滴度侧重检测病毒基因组的拷贝数，感染滴度侧重检测病毒粒子的感染性。物理滴度通常高于感染滴度。

qBac^®昆虫细胞杆状病毒表达系统非常擅长酶的表达，通常表达出的酶具有天然的结构、有效的活性和极高的产量，适于各类下游应用场景。通常酶的纯化过程在低温下进行，还会添加蛋白酶抑制剂，以确保其蛋白活性和得率。

我们具有成功表达（多次跨膜）膜蛋白的案例，。然而，膜蛋白的表达纯化是生物医学界的痛点问题，具有一定的困难。一般情况下，膜蛋白的胞内结构域（inner domain）或胞外结构域（outer domain）具有特定的功能，我们通常推荐只表达膜蛋白的胞内结构域（inner domain）或胞外结构域（outer domain），这和普通的蛋白表达策略是一致的。若需要同时表达膜蛋白的胞内结构域和胞外结构域，基于蛋白的生物物理特性，可以考虑将跨膜结构域（transmembrane domain，TM domain）截断或替换为其他柔性多肽（如n×G4S）。另外，昆虫细胞杆状病毒表达系统擅长全长膜蛋白的表达，但其后期纯化需要客户花费相当的时间和精力去充分试验。

病毒样颗粒(VLP)为病毒单一或多个结构蛋白自我组装形成的高度结构化蛋白颗粒，VLP不含有病毒的遗传物质且在形态结构上与天然病毒具有高度相似性，因此具有较高的安全性、较强的免疫原性、特异性及生物活性。VLP的组装依赖蛋白自身的组装，较高的蛋白表达量能够促进重组蛋白在胞内或培养基中发生自组装，更大概率促进VLP结构的构筑。

昆虫细胞杆状病毒表达系统，能够对表达出的蛋白进行翻译后修饰（PTMs）。糖基化作为典型的翻译后修饰类型，存在于重组蛋白中。然而，昆虫细胞的糖基化和哺乳动物的糖基化稍有不同，主要体现在哺乳动物细胞合成的糖蛋白含有唾液酸末端的杂合型N－糖链，而昆虫细胞表达的蛋白糖链仅包含数个寡糖类（甘露糖或海藻糖等），其形成的糖蛋白可能会导致过敏反应。对于解决昆虫细胞糖基化修饰缺陷的问题，用户可以采用Mimic Sf9细胞，使制备出的糖蛋白具有更完整的N-糖基化途径，在含有血清的培养液中能够表达出人源化的重组糖蛋白。

可以利用qBac®昆虫细胞杆状病毒表达系统同时表达多个蛋白。有以下策略可供选择（1）多个蛋白的基因（CDS编码区）分别整合到多个杆状病毒基因组中，通过杆状病毒的共感染，使昆虫细胞同时表达多个重组蛋白；（2）将多个蛋白的基因整合到同一个杆状病毒基因组中，通过杆状病毒最强的两个启动子（polh promoter和p10 promoter）来调控目的蛋白的表达。这种策略通常用来同时表达两个不同的重组蛋白；（3）采用更加精巧复杂的策略，确保多个蛋白的基因整合到同一个杆状病毒基因组中，使得多个蛋白同时表达并维持其天然功能。

用户可以采用亲和层析+离子交换+分子筛等纯化策略。 亲和层析中，His标签因其分子量较小，后期纯化便捷，低成本等特点被广泛使用。His标签的位置取决于重组蛋白的特性及下游应用需求，若蛋白大小适中且标签不影响后续试验，N端和C端均可；若目的蛋白较小，为延缓降解，通常建议放在C端；若后续需要切割标签，为避免氨基酸残基的切割不完全，通常建议放在N端。

通常情况下，昆虫细胞因其自身优势，表达出的蛋白是可溶的，所以我们一般不对其进行变性复性操作。如果实践中遇到可溶性差的蛋白，建议在蛋白上融合增溶标签（比如MBP）。另外，不可溶蛋白可以通过变性再复性过程提高可溶性。