杆粒生物 敬请稍候

Bac-to-Bac系统是目前使用最广泛的杆状病毒表达系统。我们经常会收到客户的询问,qBac®系统与Bac-to-Bac系统有何区别,如何从现有的Bac-to-Bac平台转移到qBac®平台。

事实上,杆状病毒表达系统可以根据引进外源基因片段的方式分为两个截然不同的体系:

1、转座方式:在大肠杆菌中通过转座子转座,将外源基因转座到Bacmid上,再用筛选到的Bacmid转染昆虫细胞,获得重组病毒。采取这个方式的主要是ThermoFisher的Bac-to-Bac系统。

2、重组方式:将带有同源臂的外源基因(外源基因克隆在特定质粒上)与Bacmid共转染昆虫细胞,在昆虫细胞内完成同源重组,获得重组病毒。采取这个方式的有我公司的qBac、OET的FlashBac、Novagen的BacMagic和Clontech的BacPAK。

其中,采取重组方式的系统都是互相兼容的,既这些公司之间的转移质粒是通用的。

那么,如何从Bac-to-Bac转移到qBac®呢?请先看看下表中的对比:

Bac-to-Bac与qBac®两个系统分步骤对比
Bac-to-Bac系统 qBac®系统 备注
1、将要表达蛋白的基因片段克隆到pFastBac或兼容质粒上。小提鉴定正确的质粒。 1、将要表达蛋白的基因片段克隆到pQB系列质粒或兼容质粒上。小提鉴定正确的质粒。 这一步是任何一个表达系统都要做的。切记,这两个系统的质粒不兼容。
2、将质粒转化到DH10Bac大肠杆菌中。    
3、蓝白斑筛选阳性克隆(已经发生转座的)。    
4、进一步用PCR鉴定阳性克隆。   Bacmid大约135kb,一般只能用PCR鉴定。
5、提取Bacmid。   因为Bacmid较大,提取时要倍加小心,防止DNA断裂。
6、用Bacmid转染昆虫细胞。转染后4-5天,收集上清获得重组病毒。 2、把质粒和我们提供的qBac® Bacmid共转染昆虫细胞。转染后5-6天,收集上清获得重组病毒。  

从上表可以看出,只需要将基因片段克隆pQB系列或兼容质粒上,即可完成平台的转移。

  • 从Bac-to-bac转移到qBac®的优点:
    • 实验步骤大幅度简化
    • 由于步骤减少,一旦实验失败,很容易找出问题所在
    • 不需要提取Bacmid。Bacmid本身很大,操作不小心就会造成断裂,严重影响转染
    • 最主要的,您可以享受到我们的高产杆状病毒表达系统带来的益处
  • 从Bac-to-bac转移到qBac®的缺点:
    • 由于需要在昆虫细胞中重组,所以获得第一代病毒的滴度稍低于Bac-to-Bac
    • qBac® Bacmid是不可复制的,所以您必须要购买我们的Bacmid

友情提示:转座方式获得的重组病毒基因组上遗留了mini-F复制子和Tn7转座子位点。有很多报道发现这种的重组病毒非常不稳定,在传代过程中会大量丢失基因。这种现象可能是mini-F复制子引起的(Pijlman et., al. 2003),也可能是Tn7转座子引起的(Pijlman et., al. 2020)。

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